一文了解qPCR原理及檢測(cè)方法~實(shí)驗(yàn)成功率翻倍！

qPCR原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一種實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法。由于其具有操作簡便、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物療效評(píng)價(jià)、基因表達(dá)分析、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、基因分型、病原體檢測(cè)、殘留檢測(cè)等領(lǐng)域。其通過在擴(kuò)增過程中引入熒光染料或熒光探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)中DNA的擴(kuò)增量，以此實(shí)現(xiàn)核酸的定量檢測(cè)。

基本原理

qPCR與傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增的基本步驟相同，包括了變性、退火和延伸。然而qPCR的關(guān)鍵區(qū)別在于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)以及定量方式。在qPCR中，反應(yīng)以循環(huán)中的首次檢測(cè)到的目標(biāo)擴(kuò)增的時(shí)間為特征，而非在一定循環(huán)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會(huì)越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測(cè)測(cè)量的是PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

擴(kuò)增曲線

在qPCR進(jìn)程中，隨著產(chǎn)物的積累，熒光信號(hào)的強(qiáng)度等比加強(qiáng)。每經(jīng)過一次循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，即可得到一個(gè)熒光擴(kuò)增曲線。

上圖是一張經(jīng)典的qPCR擴(kuò)增曲線圖。根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化。熒光擴(kuò)增曲線可分為三個(gè)階段，即熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此可以在該階段進(jìn)行定量分析。

定量原理

為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在指數(shù)期需要設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的閾值。檢測(cè)到的熒光信號(hào)超過閾值則被認(rèn)為是真正的信號(hào)。熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為Ct值。在指數(shù)擴(kuò)增期，PCR每進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，DNA呈2倍的指數(shù)關(guān)系增長，直到平臺(tái)期。假設(shè)模板量為A0，則經(jīng)過n個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物理論值A(chǔ)n應(yīng)為：

那么，起始模板拷貝數(shù)A0越多，擴(kuò)增產(chǎn)物的量便越早達(dá)到檢出值A(chǔ)n，達(dá)到An時(shí)的循環(huán)次數(shù)即Ct值。也就是起始模板拷貝數(shù)A0越多，擴(kuò)增曲線越早起峰，對(duì)應(yīng)需要的循環(huán)次數(shù)n越小。由上可得，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在反比線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，則Ct值越小。

利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的Ct值可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得未知樣品的Ct值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線便可準(zhǔn)確計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光檢測(cè)方法分類

熒光探針法

Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光發(fā)射基團(tuán)熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)定量。目前常用的熒光基團(tuán)有FAM, TET, VIC, HEX。

熒光探針具有與DNA靶標(biāo)和引物匹配的雙重特異性，這一特點(diǎn)顯著降低了非特異性擴(kuò)增的可能性，并且由于其高特異性，不需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性驗(yàn)證（熔解曲線）。同時(shí)在同一體系中，可以設(shè)計(jì)多種熒光標(biāo)記的探針及引物，實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。

該方法由于特異性高，需要探針針對(duì)特定靶標(biāo)而設(shè)計(jì)，一旦靶標(biāo)發(fā)生變化或者含量降低，都會(huì)顯著影響該方法的定量從而需要重新設(shè)計(jì)引物探針。同時(shí)，其引物探針的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，既需要精準(zhǔn)且高度匹配目標(biāo)序列，有要避免與引物重疊，同時(shí)還要保證引物探針自身的穩(wěn)定性和合理性，如比較適當(dāng)?shù)拈L度（15-25bp），合理的結(jié)構(gòu)（合理的GC數(shù)量、避免形成二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)），適宜的Tm值等。該方法引物探針的合成成本也較高。

熒光染料法

目前常用的熒光染料是SYBR Green I，是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。